De twee belangrijkste analysemethoden voor synthetische peptiden zijn HPLC en massaspectrometrie (MS). HPLC meet hoe zuiver een monster is. MS bevestigt of het juiste molecuul aanwezig is. Een betrouwbaar analyserapport gebruikt beide.

HPLC: hoe zuiver is het monster?

HPLC staat voor high-performance liquid chromatography. Voor peptiden wordt bijna altijd reversed-phase HPLC gebruikt: het monster gaat door een kolom met een apolair materiaal (meestal C18), terwijl een mengsel van water en acetonitril met een kleine hoeveelheid trifluorazijnzuur (TFA) er doorheen stroomt. Tijdens de meting neemt het aandeel acetonitril geleidelijk toe (een gradiënt).

Stoffen met een verschillende polariteit komen op verschillende momenten uit de kolom. Een UV-detector meet bij ongeveer 214–220 nanometer, de golflengte waarbij de peptidebinding licht absorbeert. Het resultaat is een chromatogram: een grafiek met pieken.

Wat betekent het zuiverheidspercentage?

Het zuiverheidspercentage is het oppervlak van de hoofdpiek gedeeld door het totale oppervlak van alle pieken. Een zuiverheid van 99% betekent dat 99% van het gemeten UV-signaal van het doelpeptide komt. Kleine extra pieken zijn meestal verkorte of gemodificeerde varianten die tijdens de synthese zijn ontstaan.

Beperkingen van HPLC

HPLC zegt niet welk molecuul in de hoofdpiek zit. Een verkeerd peptide kan ook één zuivere piek geven.
Onzuiverheden die gelijktijdig met het doelpeptide uit de kolom komen, worden niet als aparte piek gezien.
Stoffen zonder UV-absorptie, zoals water en zouten, zijn onzichtbaar. Daarom zegt de HPLC-zuiverheid niets over het netto peptidegehalte.

Massaspectrometrie: is het het juiste molecuul?

Massaspectrometrie meet de massa van moleculen. Het peptide wordt geïoniseerd, meestal via electrospray-ionisatie (ESI) of MALDI, en de massa-ladingverhouding van de ionen wordt bepaald. De gemeten massa wordt vergeleken met de theoretische massa die uit de sequentie volgt.

Komt de gemeten massa overeen met de verwachte waarde, dan is dat sterk bewijs voor de identiteit van het peptide. BPC-157 heeft bijvoorbeeld een gemiddelde molecuulmassa van 1419,5 g/mol; een MS-meting moet die waarde terugvinden.

LC-MS: beide in één meting

Bij LC-MS is de HPLC direct gekoppeld aan een massaspectrometer. Van elke piek in het chromatogram wordt dan ook de massa bepaald. Zo zie je niet alleen hoe zuiver het monster is, maar ook wat de onzuiverheden zijn. Voor complexe peptiden is LC-MS de meest informatieve methode.

Waar let je op in een rapport?

Staan zowel de HPLC-zuiverheid als de MS-identiteit vermeld?
Is het chromatogram bijgevoegd, zodat je de pieken zelf ziet?
Wordt de gemeten massa naast de theoretische massa vermeld?
Is het rapport gekoppeld aan een batchnummer?

Meer over het lezen van een volledig rapport staat in ons artikel Hoe lees je een COA voor peptiden? Beschikbare rapporten van onze batches vind je op de Lab Results-pagina.

Alle producten van LabPrime Peptides zijn uitsluitend bedoeld voor laboratorium- en onderzoeksdoeleinden.

HPLC en massaspectrometrie: zo wordt de zuiverheid van peptiden getest